桑黃是擔(dān)子菌門 (Basidiomyco- tas) 層菌綱 (Hymenomycetes)非褶菌目(Aphyllopho- rales)銹革 孔菌科(Hymenochaetaceae)針層孔菌屬(Phellinus Quel.)的一類藥用真菌，由于此種菌類大多生長(zhǎng)在 桑屬(Morus L.)植物上，且子實(shí)體為黃褐色而得名。 傳統(tǒng)中醫(yī)中，桑黃多用于治療血崩、血淋、臍腹 澀痛、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)等婦科疾病，現(xiàn)代 藥理研究表明其具有抗氧化、抗腫瘤、免疫、保 肝等功效。雖然報(bào)道中所用桑黃菌種存在差異， 但整體上看，不同菌種桑黃所產(chǎn)化合物類型比較 接近，相關(guān)藥效也類似。據(jù)報(bào)道桑黃粗多糖、 包外多糖、包內(nèi)多糖及分級(jí)純化多糖均能增強(qiáng)機(jī) 體對(duì)自由基損傷的防御機(jī)能，有效減輕脂質(zhì)過氧 化物對(duì)組織或細(xì)胞的損傷。

1 材料和試劑

1.1 動(dòng)物

ICR 小鼠，清潔級(jí)，♂，體質(zhì)量 18~22 g，購(gòu) 自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為 SCXK( 浙 )2014-0001 ，動(dòng)物合格證號(hào)為 1712120005，1712190008。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：屏障 系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，溫度 18~28 ℃，濕度 60%~80%，12 h 明暗交替。飼料來源于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物及試劑

桑黃 Inonotus sanghuang：“浙黃 1 號(hào)”菌種產(chǎn) 品，黃褐色疏松塊狀或顆粒，批號(hào)為 20180716， 由淳安千島湖桑都食用菌專業(yè)合作社提供，經(jīng)浙 江省食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥所俞建平副主任藥 師鑒定為合格藥材；維生素 E(浙江醫(yī)藥制藥有限 公司新昌制藥廠，批號(hào)：170837)；D-半乳糖(Sigma 公司，批號(hào)：785R1305J；純度：98%)；總抗氧化 能力(T-AOC)試劑盒(批號(hào)：20171130)、總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)：20171121)、總蛋白 定量試劑盒(批號(hào)：20171121)、丙二醛(MDA)試劑 盒 ( 批號(hào)： 20171120) 、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)試劑盒(批號(hào)：20171117)、過氧化酶(POD) 試劑盒(批號(hào)：20171212)、還原性谷胱甘肽(GSH) 試劑盒(批號(hào)：20180109)均購(gòu)于南京建成生物工程 研究所；Nrf2 抗體(ab62352)、HO-1 抗體(ab13243) 均購(gòu)于美國(guó) abcam 公司；β-Actin(4970s)、Ig G-HRP 標(biāo)記二抗(7074S)均購(gòu)于美國(guó) CST 公司。

1.3 儀器

AEL-200 電子天平 ( 日本島津公司 ) ；上海精宏DKZ-2B電熱恒溫振蕩水槽；Microfuge16 離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)； Synergy-2 SLFPA 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰 公司)；Western blot 轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)。

2 方法

將桑黃粉碎，稱量，加 8 倍量水，浸泡 0.5 h， 煎煮 1 h，濾過，濾渣加 6 倍量水，煎煮 0.5 h，濾 過，濾渣再加 5 倍量水，煎煮 0.5 h，濾過，合并 濾液，濃縮至生藥含量 2 g·mL?1 的桑黃水煎液。 將桑黃水煎液置于 4~8 ℃環(huán)境，冷藏保存，備用。40 只 ICR 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和桑黃 高、中、低劑量組(12，6，2 g·kg?1 )，每組 10 只， 按 20 mL·kg?1 體質(zhì)量灌胃，每天 1 次，連續(xù)給藥 15 d，末次給藥 1 h 后，取血測(cè)定血清 SOD 活力 以及 MDA 含量，取肝臟、腎臟，稱重并計(jì)算臟器 指數(shù)。取部分肝臟制備肝勻漿，采用蛋白定量試 劑盒測(cè)定肝勻漿的蛋白濃度，并按照試劑盒說明 書檢測(cè)肝組織中 T-AOC、MDA、SOD 和 GSH-PX 的活力。提取小鼠肝組織蛋白，根據(jù) BCA 試劑盒說明 書測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。取 20 μg 蛋白，在 10%的 SDS/PAGE 中以 80 V 電壓電泳。200 mA 低溫條件 下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后在 5%的脫脂奶粉封閉液中常溫封 閉 1 h。HO-1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)和 β-Actin (1∶1000)抗體 4 ℃孵育過夜。洗膜后，相應(yīng)的二 抗(1∶3 000)常溫?fù)u床孵育 2 h。用 ECL 試劑，凝 膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。

3 結(jié)果與分析

桑黃各劑量組小鼠體質(zhì)量和肝臟及腎臟系數(shù) 與正常對(duì)照組相比均無明顯差異。桑黃各劑量組血清中 SOD 酶活力 均與模型組、正常對(duì)照組無明顯差異，故未在表 中展示。與正常對(duì)照組相比，模型組血清中 MDA 和 GSH 顯著升高(P<0.01)，T-AOC 顯著降低 (P<0.05)。與模型組相比，桑黃各劑量組 MDA 含 量和 GSH 均顯著降低(P<0.01)，T-AOC 水平顯著 升高(P<0.01，P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，模型組T-AOC、SOD 和 POD 酶活力呈下降趨勢(shì)，GSH 水 平有升高趨勢(shì)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；桑黃低、 中劑量組 POD 酶活力較正常組明顯上升(P<0.01)， 桑黃高劑量組 SOD 酶活力降低(P<0.05)。與模型 組相比，桑黃各劑量組 GSH 水平無統(tǒng)計(jì)差異，而 POD 酶活力顯著升高(P<0.01，P<0.05)，桑黃中劑 量組 T-AOC 水平略有上升，SOD 酶活力顯著升高 (P<0.05)

4 討論

對(duì) 4 種桑黃不同組分進(jìn)行體外總 抗氧化能力測(cè)定，揭示桑黃水溶性組分活性較好， 故本實(shí)驗(yàn)采用桑黃水煎液進(jìn)行體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)。 在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)注射 D-半乳糖是小鼠衰老模型 的經(jīng)典方法，MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其 MDA含量高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊 的嚴(yán)重程度；SOD 能清除超氧陰離子自由基，保 護(hù)細(xì)胞免受損傷；GSH-PX 是機(jī)體內(nèi)一種催化過氧 化氫分解的酶，其特異地催化 GSH 對(duì)過氧化氫的 還原反應(yīng)，可保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用； POD 協(xié)同 SOD 和 GSH-PX 一起分解體內(nèi)自由基代 謝產(chǎn)物；T-AOC 可反映機(jī)體內(nèi)總體的抗氧化水平， 故本實(shí)驗(yàn)選擇這幾項(xiàng)指標(biāo)。



 

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