弗勞地枸櫞酸桿菌是一種條件致病的腸桿菌科細(xì)菌，天然存在于水、土壤、人與動物的腸道中，?？蓪?dǎo)致免疫低下者、長期使用廣譜抗生素以及侵入性檢查患 者的呼吸道、泌尿道、腸道等部位感染，目前是院內(nèi)感 染的重要致病菌之一。枸櫞酸桿菌屬對 β － 內(nèi)酰胺類 抗生素，耐藥性嚴(yán)重，其耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生各種 β － 內(nèi)酰胺酶，以染色體或質(zhì)粒編碼的AmpC酶較 為常見。

1 材料與方法

1． 1 材料

1． 1． 1 菌株來源

收集 2012 ～ 2017 年安徽省細(xì)菌耐 藥監(jiān)測中心每年 9 月收集的監(jiān)測網(wǎng)內(nèi)的 34 所醫(yī)院( 由 14 家三級甲等、4 家三級乙等、16 家二級甲等醫(yī)院組 成) 報(bào)送的 104 株臨床分離的弗勞地枸櫞酸桿菌。使用全自動細(xì)菌鑒定儀重新對全部弗勞地枸櫞酸桿菌進(jìn) 行菌 群 鑒 定。 藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌 ATCC25922、轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)受體菌大腸埃希菌 J53AZＲ 為安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心保存菌株。

1． 1． 2 抗生素

氨芐西林( 齊魯制藥有限公司，國藥 準(zhǔn)字 H37021316) ，頭孢哌酮 － 舒巴坦( 美國輝瑞制藥 有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20020598) ，哌拉西林 － 他唑巴 坦( 惠氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 J20150041) ，頭孢吡 肟( 深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，國 藥 準(zhǔn) 字 H20041631) ，頭孢噻肟和頭孢他啶( 華北制藥河北華 民 有 限 公 司，國 藥 準(zhǔn) 字 H13021207 和 國 藥 準(zhǔn) 字 H20064584) ，頭孢曲松( 臺灣泛生制藥廠股份有限公 司，HC20150030) ，頭孢西丁( 山東魯抗有限公司，國藥 準(zhǔn)字 H20065080) ，頭孢唑肟( 山西天星制藥有限公司， 國藥準(zhǔn)字 H20051649) ，美羅培南( 日本住友制藥株式 會社，國藥準(zhǔn)字 H20100202) ，亞胺培南( 杭州默沙東制 藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 J20130123) ，氨曲南( 深圳市海 濱制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20103468) ，阿米卡星( 上 海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 H31020590) ，慶 大霉素 ( 上海第一生化藥業(yè)有限公司，國 藥 準(zhǔn) 字 H31021994) ，環(huán)丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星均為藥 物標(biāo)準(zhǔn)品，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1． 1． 3 試劑與儀器

Mueller － Hinton ( M － H) 瓊脂 購自 英 國 Oxoid 公 司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( polynerase chain reaction，PCＲ) 體系( rTaq 酶、10 × PCＲ Buffer、 dNTP Mixture) 及 DNA Marker 標(biāo)準(zhǔn)帶均購自大連寶生 物工程有限公司。全自動細(xì)菌鑒定儀( 美國 Dade Behring 公司，MicroScanWalkAway － 40) ; 細(xì)菌多點(diǎn)接種儀 ( 英國 AQS Manufacturing 公司，A400) ; 電熱恒溫培養(yǎng)箱( 上海精宏公司，DNP9162) ; PCＲ 儀( 德國 Biometra 公司，070851) ; 凝膠成像系統(tǒng)( 上海天能科技有限公 司，Tanon5200 Multi) ; 低溫離心機(jī)( 德國 Hettich 公司， UNIVEＲSAL 32Ｒ) ; 電泳儀加電泳槽( 北京市六一儀器 廠，DYCP － 31DN) 。

1． 2 方法

1． 2． 1 抗生素敏感性試驗(yàn)

采用瓊脂稀釋法對臨床分 離弗勞地枸櫞酸桿菌和質(zhì)控菌株大腸埃希菌 ATCC25922 進(jìn)行多種不同藥物的最低抑菌濃度( minimum inhibitory concentration，MIC) 測定。結(jié)果解釋按照2017 年臨床實(shí)驗(yàn) 室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會( Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI) 推薦的腸桿菌科 MIC 標(biāo)準(zhǔn)判斷。

1． 2． 2 PCＲ 檢測

選用 SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量 抽提試劑盒提取質(zhì)粒; 中的引物及用多 重 PCＲ 方法擴(kuò)增質(zhì)粒介導(dǎo) AmpC 酶( MOX、CIT、DHA、 ACC、EBC、FOX) 基因; 引物由上海生工生物工程有限 公司合成。PCＲ 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳后，用凝 膠成相系統(tǒng)觀察比較，若出現(xiàn)與擴(kuò)增片段長度相當(dāng)?shù)?目的條帶為陽性。

1． 2． 3 PCＲ 產(chǎn)物序列分析

PCＲ 擴(kuò)增陽性產(chǎn)物，送 上海生工生物有限公司進(jìn)行測序分析。應(yīng)用 GenBank 數(shù)據(jù)庫對測序信息比對分析，以明確 AmpC 酶基因的 基因型別以及是否突變。

1． 2． 4 轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)

PCＲ 擴(kuò)增 AmpC 酶基因陽性弗 勞地枸櫞酸桿菌作為供體菌，大腸埃希菌 J53AZＲ作為 受體菌，描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)。 在同時(shí)含疊氮鈉( 200 μg /mL) 和頭孢西丁( 16 μg /mL) 的選擇性 M － H 瓊脂平板上生長的單菌落，即為接合 子。傳代 3 次后進(jìn)行生化鑒定，測定其多種抗生素的 MIC，提取其質(zhì)粒經(jīng) PCＲ 擴(kuò)增 AmpC 酶基因，并通過測 序比對確認(rèn)。

2 結(jié)果

2． 1 弗勞地枸櫞酸桿菌的標(biāo)本和病區(qū)分布

104 株弗勞地枸櫞酸桿菌臨床分離株，69 株來源于痰標(biāo)本 ( 66． 3% ) ; 其次為尿液 18 株( 17． 31% ) 、血標(biāo)本 6 株 ( 5． 77% ) 、分泌物 5 株。科室分布中排名前 3 位的科 室為呼吸內(nèi)科 32 株( 30． 77% ) 、重癥監(jiān)護(hù)病房 25 株 ( 24． 04% ) 、腫瘤內(nèi)科 12 株( 11． 54% ) 。見表 1、2。

2． 2 藥敏結(jié)果

104 株弗勞地枸櫞酸桿菌對 17 種抗 生素的敏感率及耐藥率可以看出，對亞胺培南和美羅 培南最敏感，敏感率高達(dá) 98． 08% 。相比于其他三代頭 孢類抗生素，四代頭孢菌素頭孢吡肟以及酶抑制劑復(fù)合 制劑如哌拉西林 － 他唑巴坦和頭孢哌酮 － 舒巴坦的敏 感性較好，分別可達(dá) 74． 04%、79． 81% 及77． 88%。喹諾 酮類及氨基糖苷類敏感性較好，其中左氧氟沙星敏感 性達(dá) 65． 38% ，阿米卡星敏感性達(dá)80． 77% 。2． 3 PCＲ 擴(kuò)增結(jié)果 以 104 株弗勞地枸櫞酸桿菌的 質(zhì)粒 DNA 為模板，經(jīng) PCＲ 檢測和 DNA 測序結(jié)果顯 示: 4 株 AmpC 酶基因陽性，其中3 株為 DHA － 1 基因， 1 株為 ACT － 1 基因。質(zhì)粒介導(dǎo)的 AmpC 酶基因總陽 性率為 3． 85% ( 4 /104) 。

3 討論

弗勞地枸櫞酸桿菌是革蘭陰性腸桿菌科中的兼性 厭氧菌，屬于枸櫞酸菌屬，廣泛存在于自然界及醫(yī)院環(huán) 境中，主要見于免疫力功能低下或有基礎(chǔ)疾病者，尤其 見于血液系統(tǒng)惡性腫瘤、免疫抑制劑使用、慢性阻塞性 肺部疾病及嚴(yán)重創(chuàng)傷患者中。近幾年，弗勞地枸櫞酸 桿菌仍然不是臨床十分常見分離株，但其發(fā)生感染的 頻率較以前增加，且感染部位廣泛、感染病情嚴(yán)重。 在一個(gè)院內(nèi)機(jī)構(gòu)的大型觀察型研究中，枸櫞酸桿菌感 染在革蘭陰性菌種占 0． 8% ，在腸桿菌科細(xì)菌感染中， 占 3% ～ 6%。枸櫞酸桿菌感染可以散發(fā)也可以是 院內(nèi)傳播。院內(nèi)枸櫞酸桿菌感染的死亡率達(dá) 6． 8% ， 而在 其 引 起 的 敗 血 癥 中 的 死 亡 率 高 達(dá) 17． 8% ～ 56%。