肉類含人體所需的蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等營養(yǎng)成分，是人們必需的主要副食品之一。從波及歐盟多 國的“馬肉風(fēng)波”到國內(nèi)的“老鼠肉、狐貍?cè)夂退跞饷俺溲蛉?rdquo;等事件，不僅嚴重損害了消費者的權(quán)益， 同時也帶來了諸多食品安全隱患，還可能涉及宗教信仰問題，引發(fā)社會的不安定因素。近年來，用于物種 鑒別和食品鑒定的方法在食品工業(yè)領(lǐng)域和監(jiān)管機構(gòu)中得到越來越多的關(guān)注。肉類真實性鑒別最常用的 檢測方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）和酶聯(lián)免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）技術(shù)。但這兩種方法都存在一 定的弊端，核酸的降解和肉品的復(fù)雜基質(zhì)會影響 ＰＣＲ檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，而 ＥＬＩＳＡ 易發(fā)生物種間的交叉 反應(yīng)產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而且無法實現(xiàn)多個物種的同時檢測。

１ 實驗部分

１．１ 儀器與設(shè)備

ＥｋｓｐｅｒｔＴＭｎａｎｏＬＣ４００納升液相色譜－飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用 儀（ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００，美 國 ＡＢＳＣＩＥＸ公司）；ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ 超高效液相色譜儀（美國，Ｗａｔｅｒｓ公司）；ＱＴＲＡＰ６５００＋三重四極桿－線性離子 阱復(fù)合質(zhì)譜儀（美國，ＡＢＳＣＩＥＸ公司）；ＨｅｒａｅｕｓＦｒｅｓｃｏ２１型冷凍離心機（美國，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）； ３－３０Ｋ 型高速冷凍離心機（德國，Ｓｉｇｍａ公司）；精宏DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；ＢＣ－１０００渦旋振蕩器（深圳逗點生物技術(shù)有限公司）；ＣＰＡ２２４Ｓ型分析天平（德國，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；低 蛋白吸附離心管（１．５ｍＬ，德國Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；刻度離心管（１０ｍＬ，美國 ＡｘｙｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）；超濾 離心管（Ｍｅｍｂｒａｎｅ：１０，０００ＭＷＣＯ ＨＹ，德國Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）。

１．２ 材料與試劑

碳酸氫 銨 （分 析 純，國 藥 集 團 化 學(xué) 試 劑 有 限 公 司）；硫 脲 （ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ ≥９９．０％，美 國 Ｓｉｇｍａ－ Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；３－［３－（膽酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸內(nèi)鹽（ＣＨＡＰＳ）（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ，ＶＷＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、尿素 （ＶＷＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、二硫蘇糖醇（ＤＴＴ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、碘乙酰胺（ＩＡＡ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）（美國 Ａｍｒｅｓｃｏ公 司）；測序級修飾胰蛋白酶（Ｐｏｒｃｉｎｅ，美國 Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白濃度測定試劑盒（生工生物工程上 海股份有限公司）；乙腈、水（質(zhì)譜純，德國 Ｍｅｒｃｋ公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）。實驗 前處理用水均為超純水。 雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品均為市售。

１．３ 樣品處理

１．３．１ 蛋白質(zhì)提取

稱?。保缜兴楹蟮娜忸悩悠酚冢保埃恚屉x心管中，加入５ｍＬ蛋白裂解液（７ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，４％ＣＨＡＰＳ），渦旋振蕩過夜，以１４０００ｒ／ｍｉｎ離心２０ｍｉｎ，取上清液至低蛋白吸附離心 管中備用。采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測定上清液蛋白濃度。

１．３．２ 蛋白質(zhì)酶解

根據(jù)測定的蛋白濃度，移取適量上清液到低吸附離心管中，加入尿素水溶液（８ｍｏｌ／Ｌ） 至２００μＬ，加入４μＬＤＴＴ水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ），置于３７℃恒溫反應(yīng)１ｈ。冷卻至室溫后加入２０μＬＩＡＡ 水溶 液（１ｍｏｌ／Ｌ），避光反應(yīng)１ｈ。將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，于８℃、１４０００ｒ／ｍｉｎ離心４０ｍｉｎ，除去 多余的ＩＡＡ 和鹽類等小分子成分，并用碳酸氫銨溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）洗滌超濾膜上的蛋白３次（１００μＬ× ３）。向超濾管中加入１００μＬ碳酸氫銨溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ胰蛋白酶溶液（１∶４０），輕輕搖勻，置于 ３７℃恒溫酶解５ｈ，８℃、１４０００ｒ／ｍｉｎ離心４０ｍｉｎ，加入９０μＬ碳酸氫銨溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）洗滌一次，收 集濾液，待質(zhì)譜分析。

１．４ ＮａｎｏＬＣ－ＴＯＦＭＳ條件

色譜條件：ＥｋｓｉｇｅｎｔＮａｎｏＬＣｔｒａｐＣ１８色譜柱（０．５ｍｍ×３５０μｍ，３μｍ），ＥｋｓｉｇｅｎｔＣ１８色譜柱（１５０ ｍｍ×７５μｍ，３μｍ）。流動相 Ａ 為含０．１％甲酸水溶液－乙腈（９８∶２，Ｖ／Ｖ），Ｂ為乙腈－含０．１％甲酸水溶液 （９８∶２，Ｖ／Ｖ）。梯度洗脫程序：０～０．５ｍｉｎ，９５％～９２％Ａ；０．５～５０ｍｉｎ，９２％～７６％Ａ；５０～６５ｍｉｎ，７６％ ～６８％Ａ；６５～７４ｍｉｎ，６８％～５０％ Ａ；７４～７５ｍｉｎ，５０％～２０％ Ａ；７５～８０ｍｉｎ，２０％ Ａ；８０～８１ｍｉｎ，２０％ ～９５％ Ａ；８１～９０ｍｉｎ，９５％ Ａ。流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ；進樣體積：２μＬ。 質(zhì)譜條件：采用納升電噴霧離子源（ＮａｎｏＥＳＩ），正離子掃描模式，噴霧電壓２．３ｋＶ；加熱溫度１５０℃； 氣簾氣壓 力２０６．８４ｋＰａ，霧 化 氣 壓 力４１．３７ｋＰａ；質(zhì) 譜 數(shù) 據(jù) 采 集 使 用 信 息 依 賴 的 工 作 模 式（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ，ＩＤＡ）同時進行動態(tài)背景扣除。一級 ＴＯＦ－ＭＳ單張圖譜掃描時間為２５０ｍｓ，掃描范 圍：ｍ／ｚ３５０～１５００；每次ＩＤＡ 循環(huán)最多采集３０張電荷為２＋～５＋且單秒計數(shù)大于１５０的二級質(zhì)譜，每 張二級質(zhì)譜的累積時間為５０ｍｓ，每次循環(huán)時間為１．８ｓ。

１．５ ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ條件

色譜條件：ＡｇｉｌｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ 色 譜 柱 （１００×２．１ ｍｍ，１．８μｍ），柱 溫：３５ ℃。流 動 相 Ａ 為 ０．１％甲酸，流動相 Ｂ為乙腈。梯度洗脫程序：０～０．５ｍｉｎ，９５％Ａ；０．５～４ｍｉｎ，９５％～６５％ Ａ；４～７ｍｉｎ， ６５％～５０％Ａ；７～８ｍｉｎ，５０％～１０％Ａ；８～１０ｍｉｎ，１０％Ａ；１０～１０．５ｍｉｎ，１０％～９５％Ａ；１０．５～１２ｍｉｎ， ９５％Ａ。流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ；進樣體積：４μＬ。 質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子 源（ＥＳＩ）源，正 離 子 掃 描 以 多 反 應(yīng) 監(jiān) 測（ＭＲＭ）模 式 檢 測；噴 霧 電 壓：５．５ ｋＶ；離子源溫度：５５０℃；氣簾氣壓力：２７６ｋＰａ；霧化氣壓力：３７９ｋＰａ；輔助氣壓力：３７９ｋＰａ。

２ 結(jié)果與討論 

胰蛋白酶在ｐＨ 為８．０、溫度為３７℃時的作用能力最強，因此酶解反應(yīng)在ｐＨ 相近的碳酸氫銨溶液中 進行，溫度控制在３７±０．５℃左右。在上述實驗條件下，酶解的時間是影響蛋白質(zhì)水解程度的重要因素， 實驗考察了酶解２、４、６、８、１５ｈ（過夜）后質(zhì)譜記錄的各特征肽段的檢測濃度。結(jié)果表明，鵝肉樣品的酶解 時間為４ｈ時，各肽段的檢測濃度達最高值且隨后趨于平衡。為了充分水解蛋白質(zhì)并縮短實驗前處理時 間，酶解的反應(yīng)時間選為５ｈ。特征肽段是指某一個蛋白質(zhì)所特有的肽段序列，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可作為 區(qū)分物種屬性的生物標(biāo)志物。特征肽段的選擇一般遵循以下原則：以含７～２５個氨基酸長度的肽為 宜；不含錯切或漏切的酶切位點，對于豐度較高的肽段可接受一個漏切位點；要具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)； 質(zhì)譜檢測分析時具有較好的靈敏度和峰形。借助于納升液相色譜－串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀對酶解后的多肽 溶液進行 ＦｕｌｌＭＳ－ＩＤＡ 掃 描，得到高準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入蛋白質(zhì)搜索軟件 ＰｒｏｔｅｉｎＰｉ－ ｌｏｔＴＭ ，參數(shù) 設(shè) 置 為：ＳａｍｐｌｅＴｙｐｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＣｙｓＡｌｋｙｌａｔｉｏｎ：Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ｔｒｙｐｓｉｎ；Ｉｎ－ ｓｔｒｕｍｅｎｔ：ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００；ＩＤ Ｆｏｃｕｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｕｎｕｓｅｄ ＰｒｏｔＳｃｏｒｅ（Ｃｏｎｆ）＞ ０．０５ （１０．０％）；ＲｕｎＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓ，并在 Ｕｎｉｐｒｏｔ蛋白數(shù)據(jù)庫中進行比對檢索。本文詳細比較 了雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉這些常見物種的多肽序列，找到６０條只存在于鵝肉樣品中的備選特 征肽段，然 后 在 ＮＣＢＩ網(wǎng) 站 上 進 行 ｂｌａｓｔ分 析，去 掉 非 特 異 性 的 肽 段，最 后 留 下７條 特 異 性 肽 段。利 用 Ｓｋｙｌｉｎｅ軟件導(dǎo)出上述７條異性肽段的 ＭＲＭ 離子對信息，并對離子對的碰撞能量進行優(yōu)化，建立 ＵＰＬＣ－ ＭＳ／ＭＳ方法。

３ 結(jié)論

本研究利用納升高效液相色譜－串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜平臺，結(jié)合蛋白質(zhì)檢索軟件篩選出鵝的備選特征肽 段，利用ｓｋｙｌｉｎｅ軟件導(dǎo)出的質(zhì)譜參數(shù)，建立了 ＭＲＭ 檢測方法，并對備選特征肽段進行驗證，最終確證了 ７條鵝源性特征肽段。另外，所篩選的特征肽段中有６條肽的質(zhì)譜信號與鵝肉含量呈線性相關(guān)，能夠準(zhǔn)確 地定量鵝肉成分。



 

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